热门辣子鸡美食攻略：独家秘制，食客必尝

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什么是空间转录组？空间转录组和单细胞转录组有什么区别？空间转录组学在空间中进行转录组分析，保留了转录组学的空间位置，为我们研究实体组织的空间异质性提供了新的视角。单细胞组学使我们能够了解组织样本的细胞异质性，从而了解样本内的细胞概况。单细胞组学技术被《科学》杂志评为2018 年年度突破技术，单细胞多组学技术被《自然方法》评为2019 年年度技术方法，使我们能够了解生物异质性并解决问题更高的分辨率带来更多的问题。生物学问题提供了极大的便利，但令科学界遗憾的是，这种单细胞组学技术并没有空间位置信息，就像我们知道银河系中有哪些行星，但如果不知道它们的具体位置信息一样，这仍然给科学界认识事物的本质造成了一定的问题。因此，空间转录组技术的诞生为我们提供了一种从事物的空间位置来认识事物本质的方法。目前，空间转录组学技术基本还没有达到单细胞水平。通常，在一个空间位置上存在多个小区。 10X Genomics Visum 一般为1-10 个细胞。空间转录组学可以提供空间位置，但分辨率达不到单细胞水平，单细胞转录组学的分辨率可以达到单细胞分辨率，但没有空间位置信息。因此，如果将空间转录组与单细胞转录组结合起来，它将同时具有空间位置信息和单细胞转录组。细胞分辨率为科学界提供了强大的工具，大大提高了生物体组织器官研究的分辨率和准确性。

事实上，空间转录组学的发展历史可以追溯到上个世纪，经历了漫长的发展，从早期的smFISH（单分子RNA荧光原位杂交技术）和LCM（激光线切割）技术到现在的10X Visium（空间解析全转录组信息）、Slide-Seq（溶液中的珠子）、APEX-Seq（亚细胞定位），从少量早期基因到目前的全转录组（所有基因），空间转录组技术的巨大发展近30年来，特别是10X Genomics收购Visium并随后推出10X Visium产品，极大地推动了空间转录组技术的应用。

10X Visium空间转录组基本原理

10X Visium 空间转录组是目前应用最广泛的空间转录组技术。其基本原理如下：载玻片一般有两种，一种是组织透化条件优化的载玻片，另一种是组织透化条件优化的载玻片。幻灯片用于为图书馆构建幻灯片。优化载玻片的组织透化条件主要是在建库之前。不同组织和样品的透化条件可能不同。您需要根据自己的样本组织优化透化条件，以达到后续构建的最佳透化条件。文库，这里主要的透化优化包括透化时间和透化浓度的优化。库构建幻灯片上有四个捕获区域。每个捕获区域的大小为6.5x6.5 毫米，包含5000 个点（用条形码标记的点）。每个点的直径为55 m。中心之间的距离为100m，每个点都有唯一的条形码序列，与单个细胞的细胞条形码相同。一般将切好的样品平放在载玻片中间，然后按照优化的透化条件进行透化。组织样本中的细胞会释放mRNA，然后与每个点的polyT序列结合，然后进行后续的文库。根据斑点条形码构建测序并确定缺口位置，实现空间转录组检测。需要注意的是，这里的斑点不是单细胞水平的，一般包含1-10个细胞。

10X Visium 空间转录组基本原理

空间转录组与单细胞转录组整合分析

器官系统由不同的细胞亚群组成，它们在给定组织内的空间位置与其功能密切相关。单细胞转录组表征单个细胞的转录组可以揭示给定器官内的细胞亚群。然而，在单细胞转录组所需的组织解离步骤中，单个细胞的分离破坏了有关它们在天然组织中的空间定位以及它们彼此接近的信息。鉴于近分泌和旁分泌信号在0 至200 m 范围内起作用，此类空间信息对于理解正常和患病组织中的细胞间通讯至关重要。使用空间转录组学来检查完整的组织，通过对单细胞转录组识别的特定细胞亚群中表达的基因组进行物理定位来解决这一挑战。目前的空间转录组方法本身无法提供组织中精确定位的单个细胞的深层转录组信息。然而，它们可以阐明不同基因集富集的空间位置。这将细胞亚群定位到它们所在的组织“附近”，并指定它们表达的配体和受体以影响局部细胞间通讯。因此，当一起使用时，单细胞转录组学和空间转录组学可以在其天然组织环境中定位具有转录特征的单个细胞。因此，整合单细胞转录组和空间转录组数据可能会增加我们对特定细胞亚群的作用及其在发育、稳态和疾病中相互作用的理解。

空间转录组与单细胞转录组整合分析的方法随着空间转录组技术的发展，已经发展出多种方法，目前主要有两大类：

映射方法：映射方法是将单细胞转录组细胞映射到2D或3D空间中用户定义的区域或单细胞坐标。然而，这些方法依赖于具有原型结构的组织。

反卷积：认为空间转录组是斑点，由混合细胞组织组成。通过反卷积方法预测斑点由细胞组成，然后根据细胞类型的比例进行后续研究。

事实上，空间转录组和单细胞转录组的整合分析就是在空间转录组上识别细胞亚群的过程。细胞亚群的鉴定是单细胞转录组分析中最关键的步骤。同样，对于空间转录组，其细胞亚群的识别（空间转录组和单细胞转录组的综合分析）也是空间转录组分析的关键步骤，也是下游细胞通讯和发育轨迹分析的基础。

空间转录组作图方法和单细胞转录组整合方法实际上都是多组学整合方法。其集成分析已经有很多成熟的工具，例如LIGER、Seurat Integration（Seurat 3.0及以上）和Harmony。积分方法得到的结果大多是一个点属于某种细胞类型，但实际上每个点属于多个细胞，并且一般包含不同类型的细胞。因此，这种映射方法在许多分析中并没有得到很好的应用。基于混合单元假设的反卷积方法很好地解决了这个问题。该方法更符合研究实践。因此，这里我们主要介绍反卷积方法。这里有两个工具：鲁棒单元类型分解（RCTD）和SPOTlight。

RCTD

RCTD（稳健细胞类型分解）是一种监督学习方法，可将RNA 测序混合物分解为单个细胞类型，从而将细胞类型分配给空间转录组像素。具体来说，我们利用带注释的scRNA-seq 数据来定义预期出现在空间转录组数据中的细胞类型的细胞类型特异性概况。

监督细胞类型学习中的一个相关挑战是经常提到的平台效应，即依赖于技术的文库制备对测序平台之间个体基因捕获率的影响。研究表明，如果不考虑这些平台效应，监督方法就不可能成功，因为系统技术变异性主导了相关的生物信号。这些效应之前已经在同一生物样本上的单细胞和单核RNA-seq (snRNA-seq) 的比较中被发现，但RCTD 解决了其平台效应，并且可以应用于跨不同平台的空间转录组的解开。产品分析。

RCTD 可以准确地发现模拟和真实空间转录组数据中细胞类型的定位。此外，我们表明RCTD 可以检测细微的转录组差异，以在空间上绘制细胞亚型图。最后，我们使用RCTD 计算预期的细胞类型特异性基因表达，从而能够根据细胞的空间环境检测基因表达的变化。

软件的安装

最近在GitHub 上安装的包总是不稳定。如果安装过程中报错，最好将RCTD（https://github.com/dmcable/RCTD）下载到本地然后安装。

# install.packages("devtools")

devtools:install_github("dmcable/RCTD", build_vignettes=TRUE)

软件测试

包的导入库(RCTD)

库（矩阵）

图书馆（修拉）

库(ggplot2)数据准备单细胞转录组数据的准备。通常，Seurat4.0（或Seurat3.0以上版本）分析的单细胞转录组数据的对象以RDS格式保存。通常单细胞对象包含识别的细胞类型的结果，这些结果存储在sc@meta.data矩阵中，列名称为cell_annotation。当然，也可以改成其他名字。最后生成参考数据对象，并以RDS格式保存，以方便中间文件的下次使用和存储。

sc-readRDS("sc.celltype.rds")

### 加载/预处理您的数据，这可能会根据您的文件类型而有所不同

#refdir- system.file("extdata","Reference/Vignette",package="RCTD") # 参考目录

counts- as.matrix(sc@assays$RNA@counts )#read.csv(file.path(refdir,"dge.csv")) # 加载计数矩阵

#rownames(counts)- counts[,1]; counts[,1]- NULL # 将第一列移至行名

meta_data- sc@meta.data #read.csv(file.path(refdir,"meta_data.csv")) # 加载meta_data（条形码、簇和nUMI）

cell_types-meta_data$cell_annotation； name(cell_types)- rownames(meta_data)#meta_data$barcode # 创建cell_types 命名列表

cell_types- as.factor(cell_types) # 转换为因子数据类型

nUMI-meta_data$nCount_RNA； name(nUMI)- rownames(meta_data)#meta_data$barcode # 创建nUMI 命名列表

### 创建引用对象

参考- 参考（计数、cell_types、nUMI）

#Warning in Reference(counts, cell_types, nUMI): Reference: nUMI 与计数的colSums 不匹配。如果这是无意的，请更正此差异。如果这个

#是有意的，没有问题。

## 检查参考对象（可选）

print(dim(reference@counts)) #观察数字基因表达矩阵

#[1]384475

表（参考@cell_types）

saveRDS(reference,"ref.rds") 准备空间转录组数据。空间转录组数据通常是使用Seurat包分析的空间转录组结果对象。如果没有，则主要对象需要包含空间坐标信息。这是必需的。如果没有，可以通过某种方式手动添加。这里使用的主要数据与单细胞数据相同，都是原始表达矩阵数据计数。

rds_file="空间.rds"

空间- readRDS(rds_file)

#https://github.com/dmcable/RCTD/issues/26

coords-spatial@tools$Staffli@meta.data[,1:2]#GetTissueCooperatives(spatial,scale=NULL)#拉动未缩放的组织坐标

#https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-express/software/pipelines/latest/output/images

#spatialcounts- as.matrix(GetAssayData(spatial, Assay="Spatial", slot="counts"))

空间计数- as.matrix(spatial@assays$RNA@counts)

nUMI-spatial@meta.data$nCount_RNA

名称（nUMI）-行名称（spatial@meta.data）

### 创建SpatialRNA 对象

puck- SpatialRNA（坐标，空间计数，nUMI）结果预测myRCTD-create.RCTD（puck，参考，max_cores=8）

myRCTD- run.RCTD(myRCTD, doublet_mode="doublet") #doublet_mode="doublet" 经过前面的数据准备，这里的结果预测就比较方便了。一般只有两行命令。首先，创建RCTD 对象。使用的功能是：创建.RCTD，一般参数不需要调整。这里主要参数是max_cores，这里是线程数，可以根据自己的空间转录组数据和集群资源进行调整。具体其他参数如下，可以根据自己的需求进行调整。

创建.RCTD(

空间RNA,

参考，

最大核心数=8,

测试模式=假，

基因截止=0.000125，

fc_截止=0.5，

基因截止值reg=2e-04,

fc_cutoff_reg=0.75，

UMI_最小值=100,

UMI_max=2e+07,

UMI_min_sigma=300,

类_df=NULL,

CELL_MIN_INSTANCE=25,

细胞类型名称=NULL

）然后直接运行run.RCTD。这里主要的参数是doublet_mode，即模型参数。模型参数一般是doublet，即两细胞模型，但并不是所有的spot都是两细胞模型，所以可以选择其他模型，比如multi和full，但一般选择double为multi。多意味着斑点可以有多种细胞类型，全意味着可以有任意数量的细胞类型。如果选择multi，则使用贪心算法，直到确定最终数字。具体说明如下：

如果处于双合模式，每个像素最多适合两种细胞类型。它将每个像素分类为“单峰”或“双峰”，并搜索像素上的细胞类型。如果处于完整模式，则每个像素上可以容纳任意数量的细胞类型。在多模式下，使用贪婪算法添加细胞类型，最多可达固定数量。

结果展示说明结果- myRCTD@results

# 将细胞类型比例标准化为总和为1。

norm_weights=扫描(结果$权重， 1, rowSums(结果$权重), "/")

cell_type_names- myRCTD@cell_type_info$info[[2]] #细胞类型名称列表

空间RNA-myRCTD@spatialRNA

resultsdir- "RCTD_Plots" ## 您可以将其更改为计算机上更易于访问的目录。

dir.create(结果目录)

# 绘制图

# 绘制每种细胞类型的置信权重，如full_mode 中所示（另存为

# "结果/cell_type_weights_unthreshold.pdf")

情节权重（细胞类型名称，空间RNA，结果目录，norm_weights）

# 绘制每种细胞类型的所有权重，如full_mode 所示。（另存为

# "结果/cell_type_weights.pdf")

plot_weights_unthreshold（cell_type_names，spatialRNA，resultsdir，norm_weights）

# 绘制每种细胞类型的权重，如doublet_mode 中所示。（另存为

# "结果/cell_type_weights_doublets.pdf")

plot_weights_doublet（cell_type_names，spatialRNA，resultsdir，结果$weights_doublet，

results$results_df) 此处，提取结果然后显示。这里主要有三个结果，分别是：cell_type_weights_unthreshold.pdf、cell_type_weights.pdf、cell_type_weights_doublets.pdf。结果将直接在输出目录中。这里的输出目录是：RCTD_Plots。

cell_type_weights.pdf文件主要是单个cell类型，单独绘制。每个点代表包含当前细胞类型的所有点。颜色的深浅代表细胞的比例。越红代表越高，越蓝代表越低。

cell_type_weights_doublets.pdf表示二细胞模型下某种细胞类型的所有斑点的比例。颜色的深浅代表细胞的比例。越红，越高，越蓝，越低。前两个结果有一定的阈值。超过阈值后的结果，当然还有没有阈值的原始结果cell_type_weights_unthreshold.pdf，与之前的颜色含义相同。在这里，无论值有多低，都会显示结果。

上图展示了在空间位置上点出细胞类型的结果，然后展示了空间聚类结果中每种细胞类型的数量。如下图所示，X轴代表每个空间簇，纵坐标y轴代表该颜色细胞类型的斑点数量。具体代码如下：

# 绘制“full_mode”下每种细胞类型的置信像素数。（另存为

# "结果/cell_type_occur.pdf")

plot_cond_occur（cell_type_names，resultsdir，norm_weights，spatialRNA）

RCTD 结果显示在此处。事实上，RCTD文件结果是一个矩阵。该矩阵包含每个细胞属于所有细胞类型的概率值。总和加起来为1，具体结果如下图所示：

需要注意的是，如果单个单元格数据单元格类型中包含未知的单元格类型，必须将其删除，否则会影响结果。

请继续关注我们的下一篇文章，这是SPOTlight的介绍。

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