揭秘表观遗传学：基因表达的奥秘

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RNA甲基化是表观遗传学研究的重要内容之一，是指RNA分子上不同位置发生的甲基化修饰现象。 6-甲基腺嘌呤（N6-甲基腺苷，m6A）和5-甲基胞嘧啶（C5-甲基胞苷，m5C）是真核生物中两种最常见的RNA转录后修饰。 RNA甲基化可能在调节基因表达、剪接、RNA编辑、RNA稳定性、控制mRNA寿命和降解等方面发挥重要作用。与DNA甲基化相比，RNA甲基化更加复杂、多样，普遍存在于各种高级生物体中。

真核mRNA存在多种碱基修饰行为。碱基修饰发生在5" 和3" UTR 以及中间编码区。已知大多数真核生物中，mRNA在5"端有碱基修饰，Cap处有甲基化修饰，其功能包括维持mRNA稳定性、mRNA前体剪接、多腺苷酸化、mRNA转运和翻译起始等。3"端polyA的修饰有助于核运输、翻译起始，并与PolyA 结合蛋白一起维持mRNA 的结构稳定性。然而，这些修饰仅发生在mRNA 的头部和尾部。 RNA 的内部修饰发生在许多类型的RNA 中。无论是mRNA还是lncRNA，都存在大量的m6A修饰。 m6A可以加速mRNA前体的加工时间，加快mRNA在细胞内的转运速度和离开细胞核的速度。主要研究m6A，研究较多。 RNA m6A 甲基化涉及三种类型的酶：Writers、Erasers 和Readers。需要相关研究的可以查阅相关文献。

如何检测m6A

检测m6A的方法有很多，包括MeRIPseq、miCLIP-seq、SCARLET、LC-MS/MS等。2012年之后，Nature和Cell上发表的两篇论文可以说是首次对人类和人类的甲基化水平进行了检测。小鼠m6A 在转录水平上通过高通量大规模鉴定（Dominissini 2012 和Meyer 2012）。这两篇独立发表的论文采用的核心方法是将m6A抗体与带有m6A的mRNA片段结合，然后进行高通量测序。通过分析机外数据，我们可以识别mRNA 上m6A 水平较高的区域，分辨率约为100nt。我们将此方法称为MeRIP-seq（甲基化RNA 免疫沉淀测序）或m6A-seq。

MeRIP-seq建库步骤：

1.提取总RNA，用Oligo-dT磁珠富集含有polyA mRNA的总RNA（一般需要300ug Total RNA，人和小鼠可以做微量2ug，但结果可能低图率和高dup率也有差异）；

2.使用磁珠富集，获得含polyA的mRNA。然后添加片段化试剂以片段化完整的mRNA。或者用超声波仪器直接破碎；

3. 将RNA片段分成两部分。一份添加带有m6A 抗体的免疫磁珠，以富集含有m6A 甲基化的mRNA 片段。另一种作为对照，直接构建类似于常规的转录组测序文库（此步骤为IP步骤，片段化程度和抗体捕获效率会影响后期的实验结果；这里的对照通常称为Input）；

MeRIP-seq技术检测m6A RNA甲基化过程4、富集m6A抗体免疫磁珠，回收含有m6A的mRNA片段，按照转录组文库构建流程构建常规测序文库；

5.分别对构建的两个测序文库m6A-seq文库和RNA-seq文库进行高通量测序。测序平台不变，推荐Hiseq X ten或Novaseq；

6. 对离线数据进行生物信息学分析，对m6A甲基化水平较高的区域进行峰调用。由于无法实现单个碱基的分辨率，因此只能分析粗略区域。从下图中我们可以发现，与右侧常规转录组测序结果相比，该基因上的两个区域存在非常明显的高甲基化峰；

m6A甲基化峰检出区7的标准分析。接下来会进行一些常规分析，如峰区基因注释、差异峰分析等。

以上是m6A-seq的标准步骤。现在你对m6A-seq是不是有了非常直观的认识了呢？同样，这种测序方法只能识别高甲基化区域，无法实现单碱基分辨率。

m6A研究思路

想法1 旧数据挖掘

第一步：首先从原始转录组数据中挖掘差异表达的甲基化酶；

步骤2：对发现的甲基化酶如METTL3或FTO进行qPCR验证，并进行m6A-seq分析哪些基因发生了甲基化水平的改变；

步骤3：在细胞中敲低并过表达这些酶（动物模型可选），进行常规qPCR和WB检测相关酶的表达，并使用LC-MS/MS检测RNA的总体m6A水平；

步骤4：继续对这些敲低和过表达的细胞进行转录组测序/小RNA测序或表达谱芯片/小RNA芯片，分析哪些基因存在差异表达变化和选择性剪接变化；

第五步：找到甲基化酶调控的靶基因，将其敲低并过表达，看看甲基化酶缺陷细胞或动物模型的表型能否得到挽救；

步骤6：在上一步确认目的基因确实受到甲基化酶调控后，对目的基因上的基序进行点突变并验证；

第7 步：识别新型甲基化酶（可选）。

想法2：研究甲基化差异修饰的基因

步骤1：直接进行m6A-seq和转录组测序，找到时间顺序或差异表达的基因，并通过qPCR、WB等方法进行验证。另外，寻找m6A存在差异的基因；

步骤2：敲低并过表达甲基化酶并检测RNA的总体m6A水平。然后可以通过转录组或小RNA测序等方法来测试甲基化酶的敲低和过表达对整体mRNA或miRNA的影响。影响，第一步重点研究目的m6A的差异靶基因；

第三步：敲低或过表达目的基因，看是否可以恢复甲基化酶异常表达导致的表型；

步骤4：对目的基因上的基序进行点突变，进一步确认其直接受甲基化酶调控；

第5 步：识别新型甲基化酶（可选）。

当然，根据不同的研究目的，还有很多其他的研究思路，可以根据自己的实验设计进行延伸和拓展。 m6A相关SCI论文根据实验方法不同，从IF2到20不等：m6A-seq、转录组测序/表达谱芯片、LC-MS/MS或m6A比色法、小RNA测序/小RNA芯片、qPCR、WB、knockdown /过表达、目的基因验证、动物实验、临床实验/药物实验等

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参考研究：

1. 高通量RNA甲基化测序数据处理与分析研究进展

2. RNA修饰检测技术

OK，关于揭秘表观遗传学：基因表达的奥秘和的内容到此结束了，希望对大家有所帮助。