探索微生物生态学领域：宏基因组分析技术解析

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所有宏基因组分析都是从序列reads的质量控制开始，其早期应用主要依赖于以基因为中心的方法来量化宏基因组中目标基因的相对丰度及其功能，这需要对reads进行基因检测和注释。这些发展立即增加了数据库中基因簇的数量，并激发了人们对宏基因组学应用的更大兴趣。各种工具使这种分析成为可能（表1 和表2）；然而，环境微生物组中近50% 的基因缺乏注释的功能。这与微生物分离株基因组中三分之一的蛋白质编码基因没有注释的事实相似。因此，我们识别功能基因的能力与基因数据库的完整性和我们对基因功能认识的提高密切相关。

表1 用于序列读取质量控制、组装、分箱和宏基因组组装基因组(MAG) 细化的生物信息学程序

表2 基于数据库检索发现系统发育和功能潜力的常用软件

以基因为中心的宏基因组分析可以通过独立工具或基于网络的应用程序进行。 Web服务器（表3）提供了一个用户友好的分析平台，所有经验水平的研究人员都可以访问，但它们仅限于较小的数据量，提供来自分析工具选择列表的结果，并且完成分析的时间取决于到服务器负载。

表3 支持以基因和基因组为中心的分析的宏基因组分析平台

从以基因为中心的宏基因组学中收集的信息，有时与宏转录组和宏蛋白质组相结合，可以更好地理解生态系统中控制生物地球化学循环的微生物过程。除了高度复杂和多样化的土壤和沉积物微生物组之外，对自然和工程环境的以基因为中心的分析扩展了我们对基本微生物过程的了解，例如灰尘微生物组、处理后的污水性模式中的人畜共患原生生物多样性、植物组织内部或表面的微生物（根、茎、叶）等

回到细胞：从宏基因组中恢复基因组

随着每个样本测序深度的增加，从复杂群落的宏基因组中恢复基因组变得可能。足够大的测序深度和高覆盖度的发展、从短序列读取重建DNA重叠群的方法以及根据覆盖度将组装的重叠群分类到群体基因组中已经产生了以基因组为中心的宏基因组学和宏基因组组装基因组。（MAG）。短读组装提出了独特的挑战，特别是由于群落内细菌和古细菌的丰度不同、高度多样性和菌株水平差异。下一代装配流程旨在考虑和利用这些数据的独特方面（表1）。目前的组装质量通常在不同方法之间进行比较，并通过单基因组组装方法的汇总统计数据（例如大小、重叠群N50 和最大重叠群长度）进行评估。

基因组分箱的直接输出通常包含不正确的协调序列。因此，MAG通常在分箱后进行细化和评估。完整性和污染度是评估MAG 质量的两个常用指标。

基因组解析宏基因组学改变了我们研究未培养微生物的能力，并导致了分类学、微生物生态学、生物地球化学和进化生物学方面的发现。将MAG 纳入进化树增加了已知微生物属的数量，并极大地改变了我们对微生物系统发育的理解。 MAG 分析还揭示了对微生物代谢多样性和生态位分化的新见解。

领域新宠：病毒宏基因组学

宏基因组方法的出现使得对未培养病毒的研究成为可能，并彻底重塑了我们对病毒作为地球许多生物地球化学循环中主要参与者的认识。鸟枪法宏基因组方法可以在微生物群落的背景下表征病毒，但为了获得更罕见的病毒基因组，需要有针对性的宏基因组方法。靶向方法包括细胞分选和病毒宏基因组（病毒组）。

通过组学方法发现病毒的速度是无与伦比的，新的生物信息学工具可以表征病毒生态系统影响、检测未知病毒、未培养病毒的病毒分类以及病毒的全球比较。长读长技术的发展可以检测整个病毒，与短读长技术结合可以提高病毒基因组的检测和表征。稳定同位素探针和纳米级二次离子质谱等强大的工具被用来表征病毒活性并量化病毒与宿主的相互作用。

通过元组学方法表征病毒有一定的局限性，需要注意。病毒没有通用的标记基因，大多数检测到的病毒基因的功能是未知的，其中一些基因来自宿主。这些限制给预测基因组完整性、完整分类框架以及病毒是有毒还是良性带来了挑战。

随着微生物生态学家深入挖掘宏基因组提供的新信息，微生物组的宏基因组分析将通过DNA 和RNA 测序技术的改进继续发展。长读长（10 kb）测序技术在改善基因组组装以及分类和功能分配方面具有巨大潜力，但需要考虑高错误率的限制。

在宏基因组学中越来越多地使用新平台（例如Hi-C 和Tn-seq）将增强当前的数据生成工作，并为数据存储和标准化带来新的瓶颈。随着长读长测序变得更便宜、更准确，目前使用的精心设计的MAG 发现方法将受到挑战。未来的宏基因组学将与数据分析解决方案紧密相连，促进搜索和内存高效的组装方法，与TB 到PB 的数据兼容。然而，这些分析方法的一个关键伴侣是高质量注释数据库的扩展，这对于理解微生物组功能的机制至关重要。

此外，针对低DNA 和RNA 输入的样品制备和测序方面的改进将使我们能够以较小的规模进行采样，并从更大的空间尺度获取基因组信息。进一步尝试采用当前的测序技术来实现微生物细胞内所有分子的绝对定量，可以帮助将微生物组的核心和动态功能复杂性扩展到驱动地球物质循环的更大的生物地球化学和生态系统层面的相互作用。克服方法论挑战将继续增进我们对微生物分类学、功能、生态学和进化的理解。

第一个公众号：国家基因库大数据平台

参考

Ta N、de Jong AE、Li Y、Trubl G、Xue Y、Dove NC。微生物生态学研究中的宏基因组工具。当前生物技术观点。 2021 年2 月13 日；67:184-191。