各位老铁们，大家好，今天由我来为大家分享深入解析：基因测序的基本原理及应用，以及的相关问题知识，希望对大家有所帮助。如果可以帮助到大家，还望关注收藏下本站，您的支持是我们最大的动力，谢谢大家了哈，下面我们开始吧！
1. 第一代测序（Sanger测序）
关键词：双脱氧测序、末端终止测序
1.1 正常DNA的合成过程
在模板链和引物存在的情况下，核糖体RNA分别将四种脱氧核糖酸(dNTP)转运至引物末端。然后根据互补碱基配对的原理脱水形成5"-3"磷酸二酯键。
正常的DNA合成过程
1.2 Sanger测序原理
采用链终止法，即将脱氧核糖酸（dNTP）和双脱氧核糖(ddNTP)同时加入到反应体系中。两者都可以随机整合到模板链中形成DNA，但由于缺少羟基（-OH），ddNTP的反应在整合到模板链中时随机终止。利用ddNTP的这一特性，结合电泳条带的检测或利用光源信号传输即可获得序列。
ddNTP 与引物结合后，反应无法继续。
ddNTP随机组合产生不同长度的带
每个系统都进行电泳以分别读取信号。
利用光信号转换读取
1.3 Sanger测序优缺点
优点：方法简单，准确度高，测序片段长，一次可达1kb。缺点：高成本、低通量
2. 第二代测序（Illumina测序为例）
关键词：桥式PCR，可逆末端终止，高通量，边合成边测序Illumina 的Solexa和Hiseq两个系列机器是目前全球使用最多的第二代测序机。为了获得完整的基因组，通常包括三个阶段：测序、短序列比对和序列拼接。IIIumina测序数据三大阶段的特点：读长短、一定的错误率、深度高、reads之间有pairend关系
2.1 测序
测序过程大致分为三个步骤。测序完成后，获得的原始数据将经过质量评估和控制等中间过程，然后进入短序列拼接。
测序三大步骤中制备DNA基因组样品时，单倍体选择、样品总量、DNA浓度OD需要满足要求，并注意不要降解。
2.1.1 第一步：构建基因文库
步骤一：使用超声波将待测DNA样本破碎成小片段，通常约为500bp。
步骤二：将小片段修复成钝端，并在钝端进一步添加A碱基，形成粘端。
步骤三：在粘性末端添加接头适配器、测序引物、标签等。
图书馆建设流程
最终的文库形式文库：是DNA 片段的集合。测序片段断裂后，形成文库。一般将片段小于1kb的文库称为小片段文库(pairend)，大于1kb的文库称为大片段文库(matepair)。文库的大小也称为插入片段大小，可用于后续的拼接。
2.1.2 第二步：桥式PCR
步骤一：液体流过流动池后，单个DNA 序列将被固定到流动池上。
步骤二：执行多重桥式PCR 扩增。
步骤三：多余的DNA 序列将被液体冲走，在流动池上留下相同的DNA 单链簇。
流通池
桥接PCR的一般流程。桥式PCR的目的是增加信号源，方便检测。其详细原理可参考：
修拉_
2.1.3 第三步：测序
步骤一：将DNA 聚合酶、接头引物和4 种带有碱基特异性荧光标记的dNTP 添加到反应体系中。
步骤二：合成第一个碱基后，后续反应无法正常进行。
步骤三：除去剩余的未使用的碱和试剂。
步骤四：激发基础荧光并收集信号。
步骤五：去除第一个碱基的封闭基团和荧光基团。
步骤六：重复步骤一到五。
每个序列需要测序两次。正向引物测序后会被液体洗掉，然后用反向引物对另一端进行测序。
合成测序
双端测序
读取信号类似于同一张照片的叠加
2.1.4 测序饱和度评估
目的：推测测序所需的最小数据量理论上是数据量的10倍，但实际上还有其他误差，所以会高于该值。
理论最小值
2.1.5 数据质控
1. 两个指标碱基含量分布：测序后的GC含量应与基因组GC含量相同。碱基质量分布：Q20碱基百分比（一般要求90%以上）、Q30碱基百分比（一般要求85%以上） Q20表示该位点碱基的错误率为百分之一，Q30为千分之一。
2. 用fastqc可生成质量控制报告
质量报告对比
2.1.6 测数数据处理——过滤
非基因组序列。包括接头、测序引物、标签等。N碱基过多的reads。通常，如果N 碱基占读数的10% 以上，则会被去除。低质量reads。以Q20为标准，低于一定水平的Q20比例将被剔除。去除duplication。两对相同的读数将消除一对。注：只要pairedend reads中的一个reads不满足条件，就需要移除这两个reads。 RNA-seq和16s测序时不能去除重复，否则会丢失一些丰度信息。
2.2 测序拓展内容
2.2.1 大片段文库
事实上，无论是大片段库还是小片段库，都无法完全测量一次read的全长。例如，Illumina构建的小片段文库为500bp。双端测序一般只能测两端150bp左右的长度，中间200bp无法测。但由于最初建库时的随机中断，第一次read无法测序中间序列，后续reads也会检测到中间序列。
1.png1. 构建大片段文库的目的：为了获得reads之间的物理距离关系，以方便后续的序列拼接。
2. 大片段文库的测序过程：步骤1：在大片段的两端添加生物标志物序列进行环化。
步骤2：后续步骤与小片段文库测序类似
环化处理
将大片段打碎成小片段进行测序
3. pairend和matepair文库区别测序reads方向不一致，pairend方向相反，matepair方向相反。
反向配对
matepairverse
2.2.2 测序注意事项
无法一次性对整个基因组进行测序，因为PCR技术限制了读长，并且很难保证从样本中提取的基因组的完整性。
GC偏差会影响PCR，正常GC含量为35%~65%。
所选文库的大小和读长必须协调； Denove拼接过程中，先使用小片段文库，逐渐增加文库；
二代测序无法持续测量，因为随着反应的进行，后续反应条件发生变化；同时，在簇化过程中，由于碱基反应的相位不一致，会出现错误。
2.3 短序列比对
短序列比对是将过滤后的reads重新定位到基因组中。这个过程也称为映射。
回复
2.3.1 短序列比对的四种情况
一对一、无错配一对一、有错配一对多、无错配多对多、有错配
2.3.2 短序列比对的应用
1. 与自身基因组比对1.1 计算每个站点的覆盖深度
1.2 计算参考序列覆盖率
2. 与参考基因组比对2.1 RNA测序计算基因表达
2.2 变异检测
2.3 宏基因组测序计算不同生物的丰度
2.3.3 基因差异表达计算
1. 基因结构基因结构2. 成熟mRNA成熟mRNA
3. 基因表达差异的指标3.1 FoldChange，同一基因在不同样本中表达水平的变化倍数，即RPKM值的差异。差异越大，变化就越大。
3.2 FDR校正，FDR越小，差异越显着。注：转录起始位点位于启动子区和5"UTR非翻译区之间，翻译起始位点位于CDS起始密码子处。 RPKM值消除了基因长度和测序量的差异对计算基因表达量的影响，可以直接用于比较不同样本之间基因表达量的差异（可变剪接的FPKM值）。
2.3.4 变异检测
单碱基转换：转换、颠换、删除、插入
2.3.5 物种组成和丰度计算
步骤一：16s序列长度约为1.5kb，无法一次性测试。使用双端测序和质控过滤得到不同的reads，但不能去除重复。
步骤二：将两个读取拼接到标签中
步骤三：将不同标签集群到不同的OUT
步骤四：与16s数据库比较并设置阈值。
2.4 序列拼接
又称为de nove splicing，将测序得到的reads输入到拼接软件中，利用reads之间的重叠部分进行拼接。
目前序列拼接的算法有两种：一种是Overlap-Layout-Conesensus（常用于拼接长片段如Sanger），另一种是De bruijn graph（常用于拼接短序列如Illumina）。但本质是根据序列之间的重叠进行剪接。
常见名词：reads，直接从测序获得的片段pairend和matepair，文库大小insertsize，物理长度kmer，将读段切割成更小的固定片段contig，通过kmers 之间的重叠连接成更长的片段（有时也指将读段串联成重叠群） )scaffold，重叠群通过pairend关系连接成更长的片段。
2.4.1 kmer值估计基因组大小
1. kmer定义kmer 两次读取kmer，一次是正向，另一次是反向补码。
2. 利用kmer的分布图估计基因组大小kmer分布图
2.4.2 基于德布莱英图(De bruijn graph)算法拼接
1. 构图（gregraph）是切掉kmer（13-127之间的奇数），去掉频率为1的kmer（kmer频率为1，那么对应的reads只测一次，这在高通量测序中几乎是不可能的）
2. 构建contig利用不同kmer大小的片段之间的重叠形成Debraying图，然后简化该图。理论上，该图只有一个头和一个尾，但由于测序过程中存在重复区域。实际的脑解图会有很多头和尾。然后将较短的分支去除，形成很多contig，并且contig之间没有重叠关系。
De bruijn graph3. 构建scaffold构建过程通过reads之间的配对关系，contigs连接成更长的序列，这就是scaffold。首先，将测序的读数重新定位到重叠群，然后记录配对比较。落在同一contig用于计算insertsize，落在不同contig用于构建scaffold。 （例如：reads1对齐到contig1的末尾150bp，reads2对齐到contig2的开头150bp。reads1和reads2之间的insetsize为500，那么在连接contig1和contig2的过程中就会有200bp的N个碱基(存在) 比较过程中要注意reads的方向。
作图通常需要三对以上的不同重叠群来确定物理位置关系，并进一步将它们连接成支架。
image.png 当基因组中重复序列过多时，pairend关系可能不足以确定contig之间的位置关系。在这种情况下，需要使用matepair库。拼接策略：先使用小片段库，然后逐步添加大片段库。然而，获得完整的基因组序列通常很困难。特点支架序列方向不一致，有的来自有义链，有的来自反义链（但都是5"-3"）。
脚手架之间没有位置关系，但有些软件会按大小顺序输出。
scaffold中可能存在N碱基，但contig序列中没有N碱基。4. 补洞基因组中的孔（称为间隙）由N 个碱基组成。间隙是在重叠群形成支架的过程中产生的。
有关gap：N个碱基数是由insertsize决定的，但并不完全准确。 N碱基来自基因组的复杂区域（重复、GC异常等）并且不容易剪接。补洞策略
使用桑格测序长片段补洞
如果N区太大（超过2k），可以用pacbio测序来补长片的空洞。
利用pairend关系补洞
3. 第三代测序
主要包括三种测序技术，分别利用光信号、电信号和化学信号的转换
3.1 PacBio公司的SMAT
1. 原理概述应用边合成边测序的思路，利用SMRT芯片作为测序载体，将DNA聚合酶与模板结合，用4色荧光标记4个碱基。在碱基配对阶段，不同碱基的加入会发出不同的光，根据光的波长和峰值可以确定传入碱基的类型。保持酶活性，区别反应信号与周围游离碱基荧光背景是关键技术。2. 特点读长长，测序速度快，测序错误率高，可达15%。然而，错误是随机的，可以通过多次测序来有效纠正。
3.2 Oxford公司的Nanopore
1. 原理概述根据碱基影响电流变化幅度不同的特点，设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价连接有分子连接体。当DNA 碱基穿过纳米孔时，它们会改变电荷，从而短暂影响流经纳米孔的电流强度。敏感的电子设备检测这些变化并识别通过的碱基。这是一种基于电信号的方法。它不是光信号的排序技术。
2. 特点的读长非常长，达到几十kb，甚至100kb。错误率在1%到4%之间，属于随机错误。通量高，可直接读取甲基化胞嘧啶。
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用户评论
我一直对基因测序很感兴趣，想知道具体是如何工作的
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看了这篇标题，感觉可以学到很多关于DNA测序知识啊
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测序技术真是太神奇了，现在已经应用到医疗、农业等很多领域
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希望能详细了解不同种类的测序方法
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这个原理是不是很难理解呢？
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我记得以前生物课上学过点测序的概念，但不太清楚具体操作步骤
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文章能介绍一下测序的历史发展吗？
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希望这些知识能够帮助我更好地了解基因研究
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这篇文章的图示会不会很直观呢？
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我比较想了解测序在医学诊断中的应用
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测序技术的发展对人类有什么意义？
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学习一下测序原理，可以让我更全面地了解生物科技
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这篇文章能回答哪些关于测序成本的问题呢？
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是否会介绍测序技术的局限性以及未来发展方向？
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我想知道测序技术对环境保护有什么影响？
有17位网友表示赞同！
这篇文章会不会讲到一些与测序相关的伦理问题？
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测序技术的发展是不是会带来一些新的社会挑战？
有9位网友表示赞同！
我很期待看到这篇关于测序原理的文章！
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